實(shí)驗(yàn)名稱：聲化學(xué)誘導(dǎo)艾氏腹水瘤細(xì)胞凋亡機(jī)制初探

　　研究方向：生物醫(yī)學(xué)

　　測(cè)試目的：

　　聲動(dòng)力學(xué)療法(Sonody namic therapy，SDT)是利用超聲(Ultrasound，Us)具有深部穿透及準(zhǔn)確聚焦于生物組織局部的能力，激活相對(duì)無毒并且能在腫瘤細(xì)胞中特異性富集的聲敏劑分子血卟啉衍生物，產(chǎn)生具有高氧化活性的單線態(tài)氧等自由基，能有效地殺腫瘤細(xì)胞從而治療癌癥的新方法。

　　學(xué)者主要提出超聲空化效應(yīng)、單線態(tài)氧理論、自由基理論等，但聲動(dòng)力學(xué)療法對(duì)腫瘤細(xì)胞作用的生物學(xué)機(jī)制仍不清楚。在超聲激活血卟啉殺傷癌細(xì)胞的研究中，通過掃描電鏡、透射電鏡以及PI-HO和Annexin V-PI熒光雙染，觀察受損后細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化，曾發(fā)現(xiàn)處理后的S180和艾氏腹水腫瘤細(xì)胞(EAT)有核物質(zhì)凝集、趨邊排列以及凋亡小體的形成等細(xì)胞凋亡特征，提示聲動(dòng)力學(xué)療法不僅能直接殺傷腫瘤細(xì)胞，還可通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡來治療癌癥。前期聲動(dòng)力學(xué)療法抗癌的形態(tài)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，線粒體是較為敏感易變的細(xì)胞器之一，它不僅是細(xì)胞的能量代謝中心，氧自由基的重要產(chǎn)生部位，而且與脊椎動(dòng)物細(xì)胞凋亡的調(diào)控密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)采用頻率為1.43MHz，聲強(qiáng)為3.0W/cm²的高頻聚焦超聲和濃度為0.025mg/ml的血卟啉處理艾氏腹水腫瘤細(xì)胞，通過檢測(cè)3種促凋亡蛋白的表達(dá)、超氧化物歧化酶的活性以及膜脂質(zhì)過氧化物的含量，研究超聲激活血卟啉誘導(dǎo)艾氏腹水瘤細(xì)胞的凋亡機(jī)制及其與氧自由基的關(guān)系。

　　測(cè)試設(shè)備：ATA-M110高頻功率放大器模塊、昆明系小白鼠、艾氏腹水腫瘤細(xì)胞系、超聲探頭、血卟啉衍生物為單羥乙基單乙烯基次卟啉、細(xì)胞色素c和Bax單克隆抗體、caspase-3單克隆抗體、鏈霉卵白素SP試劑盒。

　　實(shí)驗(yàn)過程：

　　接種艾氏腹水腫瘤細(xì)胞于10只小鼠腹腔1周后，隨機(jī)取5只小鼠(其余5只備用)，抽取腹水細(xì)胞，分別置于醫(yī)用薄壁試管(含RPMI 1640+10%小牛血清培養(yǎng)基)，于37℃CO₂孵箱培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)時(shí)用生理鹽水調(diào)整細(xì)胞濃度至3×10⁶cells/ml。每只小鼠抽取的腹水細(xì)胞再分為4管，每管0.5ml細(xì)胞懸液，分別設(shè)為對(duì)照組(CT)、血卟啉組(H)、超聲組(Us)和超聲加血卟啉組(UH)。H組和UH組每管中加入血卟啉5μl，使其終濃度為0.025mg/ml，37℃CO₂培養(yǎng)箱孵育45min，Us組和UH組分別在頻率為1.43MHz，強(qiáng)度為3.0W/cm²的超聲裝置中聲照處理3min。各實(shí)驗(yàn)組分別于不同時(shí)間段取材處理。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，以確認(rèn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性。

　　免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)Bax，細(xì)胞色素c，caspase-3蛋白表達(dá)各實(shí)驗(yàn)組分別于超聲處理后0h，1h，3h取材。常規(guī)細(xì)胞涂片，丙酮固定10min，PBS洗滌3次，每次5min；含0.3%TritonX-100的PBS處理10min，以增加膜通透性，PBS洗滌3次，每次5min；0.3%H₂O₂-甲醇于37℃處理15min，封閉內(nèi)源性過氧化物酶，PBS洗滌3次，每次5min；正常山羊血清于37℃封閉30min，封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)；分別滴加抗Bax、細(xì)胞色素c和caspase-3單克隆抗體(1∶100，1∶50，1∶500)，4℃孵育過夜，陰性對(duì)照組以0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)取代一抗；加入的二抗為生物素標(biāo)記羊抗兔IgG或生物素標(biāo)記羊抗小鼠IgG，室溫孵育1h，PBS洗滌3次，每次5min；滴加辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素工作液，室溫孵育1h，PBS洗滌3次，每次5min；DAB顯色，梯度酒精脫水，中性樹膠封固蓋片。

　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

　　根據(jù)免疫細(xì)胞化學(xué)光鏡觀察結(jié)果和兩因素重復(fù)測(cè)量方差分析可見，不同處理方法對(duì)Bax，細(xì)胞色素c和caspase-3蛋白有極顯著影響，不同取材時(shí)間對(duì)這三種凋亡蛋白亦有極顯著影響。Tukey HSB法多重比較顯示：0h時(shí)各實(shí)驗(yàn)組之間無顯著性差異(P>0.05)；處理1h時(shí)，UH組的3種促凋亡蛋白表達(dá)均高于其它3個(gè)處理組(U，H和CT組)，差異極顯著(P<0.01)；3h時(shí)，U組和UH組3種蛋白表達(dá)均比CT組和H組高，差異極顯著(P<0.01)，UH組的蛋白表達(dá)高于U組，差異極顯著(P<0.01)。而3種促凋亡蛋白表達(dá)的時(shí)滯效應(yīng)分析結(jié)果也表明：各實(shí)驗(yàn)組中CT和H組的3種促凋亡蛋白隨時(shí)間延長(zhǎng)表達(dá)量無顯著變化；U組的蛋白表達(dá)量在處理3h時(shí)顯著升高；UH組的蛋白表達(dá)量隨時(shí)間延長(zhǎng)持續(xù)升高(平均光密度值表示陽性細(xì)胞蛋白表達(dá)強(qiáng)度，平均光密度值越小則表達(dá)信號(hào)越強(qiáng))。

　　EAT細(xì)胞中SOD活力和MDA水平測(cè)定結(jié)果，超聲+血卟啉處理EAT細(xì)胞后1h取材，發(fā)現(xiàn)與CT和H組相比，U組的SOD活力略有降低，但不顯著(P>0.05)，細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化水平無顯著變化(P>0.05)，UH組的SOD活力顯著降低，細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化水平顯著升高。(P<0.01)

　　表1：Tukey HSB法對(duì)不同取材時(shí)間Bax、細(xì)胞色素c和caspase-3平均光密度值(×10^-4)的多重比較

　　圖1：不同時(shí)間段取材各組Bax蛋白平均光密度值變化

　　圖2：不同時(shí)間段取材各組細(xì)胞色素c蛋白平均光密度值變化

　　安泰ATA-M110高頻功率放大器模塊：

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