實(shí)驗(yàn)名稱：聚焦超聲對S180腫瘤細(xì)胞膜理化性質(zhì)的影響

　　研究方向：生物醫(yī)療

　　測試目的：

　　細(xì)胞膜是細(xì)胞生命活動中有著復(fù)雜功能的重要結(jié)構(gòu)其基本作用在于維持細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境的相對穩(wěn)定而其通透性、完整性及流動性等理化性質(zhì)則與胞內(nèi)外信息傳遞、物質(zhì)能量交換等多種功能有著密切的關(guān)系?膜的有序結(jié)構(gòu)影響著生命活動的正常進(jìn)行。當(dāng)細(xì)胞癌變后?癌細(xì)胞膜更新較快?比正常細(xì)胞更易受到外界環(huán)境的影響?因此成為近年來腫瘤細(xì)胞分子生物學(xué)研究的熱門領(lǐng)域。有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)?超聲在處理細(xì)胞時(shí)?可促使細(xì)胞膜局部破裂?從而改變細(xì)胞質(zhì)膜的通透性使胞內(nèi)物質(zhì)釋放或使胞外物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞?進(jìn)而影響細(xì)胞執(zhí)行正常的生理活動。超聲的作用機(jī)制一般包括：機(jī)械作用、熱效應(yīng)和空化作用，有研究表明主要是超聲空化作用引起的機(jī)械剪切力和熱效應(yīng)導(dǎo)致細(xì)胞膜改變，但其具體的作用機(jī)制并不清楚。因此本實(shí)驗(yàn)采用超聲頻率為2.2MHz?篩選最佳的聲照強(qiáng)度及處理時(shí)間以作用于S180腫瘤細(xì)胞?通過檢測細(xì)胞內(nèi)FD500的陽性染色率和熒光強(qiáng)度、乳酸脫氫酶釋放量及膜流動性的改變以研究超聲對S180細(xì)胞膜的損傷作用；并初步探討單純聚焦超聲造成這些改變的具體作用機(jī)制。

　　測試設(shè)備：ATA-8202射頻功率放大器、有流式細(xì)胞儀、熒光顯微鏡。

　　實(shí)驗(yàn)過程：

　　接種S180腫瘤細(xì)胞于ICR系健康小白鼠腹腔1周左右，收集腹水細(xì)胞并稀釋，重懸于0.85％生理鹽水，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為1.0×10⁶cells／ml，同時(shí)臺盼蘭染色計(jì)數(shù)保證細(xì)胞存活率在99％以上。將細(xì)胞分裝在醫(yī)用一次性薄壁采血管中（1ml／管），并隨機(jī)分為對照組（CT）和不同超聲處理組（U），每組三管然后進(jìn)行聲超處理，實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)三次以確認(rèn)結(jié)果的可靠性。

　　采用頻率為2.2MHz聲照時(shí)間為60s，超聲強(qiáng)度分別為0、1、2、3、4、5、6、7W／cm²；采用聲照強(qiáng)度為3W／cm²，處理時(shí)間分別為0、15、30、45、60、90s作用于S180細(xì)胞。臺盼蘭拒染法檢測不同處理后細(xì)胞的相對存活率，臺盼蘭配成0.4％的染液，聲照處理后取部分細(xì)胞懸液用臺盼蘭染色后在光鏡下用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。細(xì)胞相對存活率計(jì)算公式：存活率＝實(shí)驗(yàn)組拒染細(xì)胞數(shù)／對照組拒染細(xì)胞數(shù)×100％。

　　收集S180腫瘤細(xì)胞并稀釋調(diào)整細(xì)胞密度為1.0×10⁶cells／ml，分裝于一次性醫(yī)用采血管中（1ml／管）。將各管細(xì)胞隨機(jī)分為1個(gè)對照組和2個(gè)實(shí)驗(yàn)組（不同聲照時(shí)間組），每組3管。其中對照組每管加50μl生理鹽水，各實(shí)驗(yàn)組每管避光加入50μlFD500工作液（終濃度為10mg／ml），輻照實(shí)驗(yàn)完畢，即刻離心收集細(xì)胞，用PBS反復(fù)洗滌，懸浮，高速離心以除凈細(xì)胞外FD500。流式細(xì)胞儀檢測熒光染色陽性細(xì)胞（FD500進(jìn)入細(xì)胞）每個(gè)樣品檢測1.0×10⁴個(gè)細(xì)胞；同時(shí)熒光顯微鏡觀察熒光染色陽性細(xì)胞，至少觀察十個(gè)視野并以CCD捕捉圖像（×40）。

　　LDH釋放是細(xì)胞膜損傷的敏感指標(biāo)之一，實(shí)驗(yàn)完畢后，采用LDH試劑盒測定各組細(xì)胞膜的損傷程度，步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。計(jì)算公式：LDH活性（U／L）＝（測定空白管吸光度值－空白管吸光度值）／（標(biāo)準(zhǔn)管吸光度值－標(biāo)準(zhǔn)空白管吸光度值）×標(biāo)準(zhǔn)管濃度（2μmol／ml）×樣本測試前稀釋倍數(shù)。LDH單位酶活性定義為每毫升細(xì)胞懸液（1.0×10⁶cells）在本反應(yīng)體系中使反應(yīng)液中2μmol／ml2，4-二硝基苯肼轉(zhuǎn)化為丙酮酸二硝基苯腙所需的酶量。

　　熒光偏振法檢測細(xì)胞膜脂流動性，配制2×10^－3mol／mlDPH母液，于用前用PBS稀釋為標(biāo)記膜脂的2×10^－6mol／mlDPH，37℃溫育30min，PBS洗滌四次后懸于4ml0.1mol／LPBS中，在激發(fā)波長360nm，發(fā)射波長430nm處測定熒光偏振度P，計(jì)算膜脂流動性LFU＝0.5－P／P²。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

圖1：不同超聲強(qiáng)度下各組細(xì)胞的相對存活率

　　1、超聲輻照最佳強(qiáng)度的篩選

當(dāng)超聲輻照時(shí)間為60s，不同強(qiáng)度的聚焦超聲對S180腹水瘤細(xì)胞的殺傷作用如圖1所示。由圖1可看出隨著聲照強(qiáng)度的增加，U組細(xì)胞相對存活率下降趨勢明顯，反映出細(xì)胞受損程度不斷加深。超聲強(qiáng)度為1W／cm²時(shí)，U組細(xì)胞相對存活率為95.83％，當(dāng)其強(qiáng)度增加至2W／cm²時(shí)，細(xì)胞存活率下降幅度有所增加（89.67％），而當(dāng)超聲強(qiáng)度為3W／cm²，U組細(xì)胞相對存活率驟降至61.81％（P＜0.01）。當(dāng)超聲強(qiáng)度大于3W／cm²時(shí)，細(xì)胞相對存活率均急劇下降，但其總體趨勢趨于平緩，當(dāng)強(qiáng)度增加至7W／cm²時(shí)，存活率僅為2.38％，其損傷程度顯著上升。由此可見，輻照強(qiáng)度3W／cm²為超聲處理S180細(xì)胞的強(qiáng)度閾值，低于3W／cm²損傷程度過小，效果不明顯，高于3W／cm²細(xì)胞受損加重，可能無法完成自身修復(fù)，而導(dǎo)致細(xì)胞即刻溶解。結(jié)果表明3W／cm²的聚焦超聲是引發(fā)S180細(xì)胞膜損傷效應(yīng)的最佳處理強(qiáng)度。

圖2：不同處理時(shí)間各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的存活率

　　2、不同超聲處理時(shí)間對細(xì)胞存活率的影響

超聲照強(qiáng)度為3W／cm²U組細(xì)胞存活率隨聲照時(shí)間延長而下降，超聲處理15s時(shí)，其細(xì)胞相對存活率（91.13％）較對照組差異不顯著（P＞0.05）；當(dāng)超聲處理時(shí)間增加到30s時(shí)，其細(xì)胞存活率降至80.65％，與對照組相比差異較明顯（P＜0.05）；隨著聲照時(shí)間延長至60s時(shí)，細(xì)胞存活率較對照組差異極顯著（61.77％）；當(dāng)輻照時(shí)間進(jìn)一步增至90s時(shí)，細(xì)胞損傷程度大幅度增加（43.22％）。結(jié)果表明：超聲對細(xì)胞造成的損傷程度隨著輻照時(shí)間的增加而升高，且30s時(shí)細(xì)胞明顯受損，而60s則是超聲處理S180細(xì)胞的時(shí)間閾值，因此本實(shí)驗(yàn)選用30s和60s作為輻照時(shí)間參數(shù)以進(jìn)一步研究超聲引發(fā)的膜損傷的時(shí)效關(guān)系。

圖3：不同處理組S180細(xì)胞FD500陽性染色率

　　3、超聲對細(xì)胞膜通透性的影響

　　大分子熒光物質(zhì)FD500，通常難以進(jìn)入胞膜完整的細(xì)胞。研究表明熒光右旋糖酐（FITC）不黏附在細(xì)胞膜上且FD500極少進(jìn)入死細(xì)胞，因此FD500進(jìn)入活細(xì)胞而使其染色可作為膜孔形成的主要標(biāo)志之一。采用流式細(xì)胞儀檢測FD500熒光染色陽性細(xì)胞對照組陽性細(xì)胞率僅為1.23％，而超聲輻照30s與60s的陽性細(xì)胞率分別為14.17％和18.65％。同時(shí)由熒光顯微鏡觀察各組細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)：對照組幾乎分辨不出熒光現(xiàn)象；30s與60s處理組的熒光。強(qiáng)度則明顯增加。

　　安泰ATA-8202射頻功率放大器：

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