微流控技術是一種通過微小的通道和微型裝置對流體進行精確操控和分析的技術。它是現代醫學技術發展過程中的一種重要的生物醫學工程技術，具有廣泛的應用前景和重要性。它在高通量分析、個性化醫療、細胞篩選等方面有著巨大的潛力，Aigtek安泰電子今天就將為大家分享一篇微流控領域研究成果，一起接著往下看吧~

　　缺血性腦卒中是由于大腦供血不足導致神經功能的缺失。它包括炎癥和免疫、細胞的死亡和分化、缺氧、血管損傷和大腦微環境改變等一系列的時空事件。干細胞治療在動物實驗和臨床試點研究的支持下，已成為中風治療的一個新興方式。每種干細胞都有獨特的特性和再生潛力，但是目前還缺乏一個可靠的中風模型來系統地比較各種候選細胞類型的療效，并研究干細胞治療的潛在機制。動物模型在時間和成本效率上也有固有的局限性，無法成為表征多種干細胞類型對中風引起的整個病理事件級聯的治療潛力的理想實驗平臺。

近期，斯坦福大學醫學院神經外科的Wonjae Lee團隊在Nature Biomedical Engineering上發表了題為A neurovascular-unit-on-a-chip for the evaluation of the restorative potential of stem cell therapies for ischaemic stroke的文章，利用微流控芯片技術開發了一個具有神經血管（NVU）的中風微生理系統，可用于檢測干細胞治療的神經恢復能力。此種中風模型使用人源細胞，并有一個類似于體內的3D微環境，能重現治療用干細胞和NVU宿主細胞之間的相互作用。他們還使用該模型系統地分析了目前用于治療中風的各類干細胞的神經恢復能力。

　　干細胞移植到缺血大腦的治療效果主要取決于神經血管單元的反應。研究人員報告的適用性功能神經血管單元的微流控芯片作為微生理缺血性中風模型,概括了血腦屏障的功能,以及治療性干細胞和宿主細胞之間的相互作用(人腦微血管內皮細胞、周星形膠質細胞、小膠質細胞和神經元)。研究人員使用該模型來跟蹤一些干細胞的浸潤，并描述與卒中后病理相關的基因表達水平。他們觀察到，每種類型的干細胞都顯示出獨特的神經恢復作用，主要是通過支持內源性恢復而不是通過直接的細胞置換，突觸活動的恢復與神經血管單元的結構和功能完整性的恢復有關，而與神經元的再生無關。

　　圖1在微流控芯片中重建的腦血管屏障（BBB）的表征。A.物理屏障。芯片設計原理圖(i).培養方案(ii).（NEM/AM，神經擴張培養基和星形細胞培養基的混合。NDM/AM，神經分化培養基與星形細胞培養基混合。ECM/PM，內皮細胞培養基和周細胞培養基的混合物。）神經細胞包括神經元、星形膠質細胞和小膠質細胞，其最終比例預計為8:4:1。血管細胞包括內皮細胞和周細胞，比例為9:1。芯片中NVU組成細胞的空間分布(iii)。明場圖像顯示水凝膠(藍色)部署在腦通道(iv)。相位對比(v)和熒光(vi)圖像顯示血側(左)通道和腦(右)通道之間清晰的邊界(白色箭頭)。分別用抗cd31和抗gfap抗體對內皮細胞和星形膠質細胞進行染色。形成的內皮層阻止了綠色熒光探針(FITC右旋糖酐，4kda)在其上的自由擴散(vii)。加入探針1小時后拍攝圖像。單層共聚焦顯微鏡圖像顯示水凝膠側壁形成的內皮細胞(viii)。內皮細胞進行VWF染色。共聚焦顯微鏡圖像的三維重建視圖顯示均勻的內皮細胞(ix)。內皮細胞和星形膠質細胞分別進行了特異性標記CD31和GFAP染色。切片中內皮細胞表觀滲透性系數Papp的對數變換值(n=5)(x)。B.生物化學屏障。血側通道含血清培養基和腦脊液側通道無血清培養基混合培養條件示意圖(i)。在無內皮細胞(白色箭頭表示水凝膠邊界)的樣品中，小膠質細胞(IBA-1染色為綠色)顯示CD68表達上調(紅色)，在有重建內皮細胞的樣本中，大部分小膠質細胞不表達CD68(iii)。有內皮細胞和沒有內皮細胞的樣本之間的CD68表達(n=3)(iv)。C.細胞選擇障礙。癌細胞合并示意圖(i)。將兩種人乳腺癌細胞系MB-231和MB-231Br的預染色細胞注入血側通道。MB-231(ii)和MB-231Br(iii)的熒光圖像在注射后3d拍攝。白色箭頭表示水凝膠邊界。測量了血腦屏障外滲的程度(n=3)。

　　圖2缺血模型建立。A.活/死檢測:在常氧(i)和缺血(ii)條件下，活細胞用鈣黃素染色為綠色，死細胞用乙二胺(EthD-1)染色為紅色。使用活/死測定法定量測定生存能力(n=3)(iii)。通過細胞外LDH水平測定細胞毒性(n=5)(iv)。在缺氧時，HIF-1α主要位于胞漿(v和vi)，在缺血時，HIF-1α聚集在細胞核(vii和viii)。B.缺血引起的基因表達變化。

　　圖片圖3神經元、內皮細胞和周細胞行為。A.神經元的行為。常氧樣本中神經元的相位對比圖像(i)。白色箭頭表示水凝膠邊界。來自hiPSCs的神經元表達成熟的神經元標記物MAP-2和突觸素I和II(SYN)。對NVU細胞成分進行神經元標記物MAP-2和星形細胞標記物GFAP的免疫染色。幾乎沒有彩色的神經元(iv)。Fluoro-JadeC染色神經元缺氧(vi)。基因表達改變的缺血(vii)。分化NPCs(viii至xiii)中胞漿鈣離子(Ca2+)的自發振蕩。NPCs用DiL(紅色)預染色。采用fluo-4am(綠色)檢測細胞內Ca2+濃度。從4個獨立的樣本中隨機選擇表達il的細胞，在缺氧狀態(n=34個細胞)和缺血狀態(n=14個細胞)各2個。分化后的NPCs在10min內表現出4種不同的Ca2+振蕩模式(ix)，標記的細胞分別表現出振蕩模式、瞬變模式、持續模式和不明顯模式。為每個Ca2+細胞的比例數字振蕩模式(x)和細胞數量的變化(xi)。由于缺血細胞鈣振蕩的振幅和頻率顯示振蕩Ca2+信號。B.內皮的行為。熒光(i和iii)和相位對比(ii和iv)圖像顯示有或沒有流動的內皮形態。ZO-1和VEGF表達遍布于缺血的內皮。ZO-1表達的整體程度內皮通過引入流量增加和減少在缺血性疾病(n=3)(vi)。ZO-1表達式的空間分布在單個細胞量化通過計算像素的數量(y軸)相應的熒光強度(x軸)。ZO-1表達式在缺血性細胞分散在整個胞體與局部峰值的模式顯示在常氧細胞。內皮在缺血時上調VEGF表達(n=3)(ix)。C.周細胞的行為。少量周細胞暴露在內皮(i)和腦通道(ii)側壁之間。白色箭頭表示周細胞。

　　圖4星形膠質細胞和小膠質細胞行為。A.星形膠質細胞的行為。常氧星形膠質細胞中的AQP4定位于水凝膠側壁形成的內皮(i和ii)，而缺血星形膠質細胞中的AQP4分布于胞體(iii和iv)。常氧(v)和缺血(vi)星形膠質細胞中GFAP的表達。在常氧和缺血樣本中，星形細胞胞體的最長和最短軸的比值(vii)。分析了來自3個獨立芯片的15個細胞。定量的星形膠質細胞GFAP在常氧和缺血樣本中的表達水平(n=3)(viii)。B.小膠質細胞的行為。缺血時小膠質細胞(用抗iba-1抗體染色)上調CD68的表達(i和ii)。正常氧和缺血樣本中小膠質細胞體的最長軸和最短軸的比值(iii)。小膠質的表達il-1β和CD68在常氧和缺血性(3h和24h)樣品.小膠質細胞移植的表達il-1β只在最初幾個小時的局部貧血的發病.CD68在整個時間缺血小膠質細胞中表達(n=3)(xi)。

　　該研究概述了體外正常和缺血條件下的NVU行為，從而有效和系統地評估干細胞治療的療效，克服了動物模型和目前可用的體外模型的局限性。這項研究的結果，特別是不同干細胞的神經恢復潛力的特征，可以在研究和臨床中引導干細胞治療的方向。這項工作中提出的方法也立即適用于廣泛的其他脈管系統相關疾病，在精準醫療領域開辟了新的可能性。

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　　參考文獻

Lyu, Z., Park, J., Kim, KM. et al. A neurovascular-unit-on-a-chip for the evaluation of the restorative potential of stem cell therapies for ischaemic stroke. Nat Biomed Eng 5, 847–863 (2021). 

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